ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ПРОАПОПТОТИЧЕСКОГО БЕЛКА Р53 В СЕЛЕЗЕНКЕ КРЫС ЛИНИИ WISTAR В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

Матеріали
конференції
УДК: 616.379-008.64-092.9:[616.411-002.191.091.818:577.112] А.М. Камышный, И.В. Гриневич, В.А. Камышная
Особенности экспрессии проапоптотического белка р53 в селезенке крыс линии Wistar в норме и при экспериментальном сахарном диабете
Запорожский государственный медицинский университет
Ключові слова: селезінка, діабет, р53.
Ключевые слова: селезенка, диабет, р53.
Key words: spleen, diabetes, p53.
В експерименті досліджено вплив експериментального цукрового діабету на інтенсивність експресії проапоптотичного білка р53 у селезінці щурів. Для виявлення р53+-клітин використовували імуногістохімічний метод непрямої імунофлюоресценції з моноклональними антитілами до р53 щура. Встановлено, що розвиток експериментального цукрового діабету супроводжується збільшенням кількості p53+-клітин у лімфоїдних фолікулах селезінки й не впливає на їх кількість у периартеріальних лімфоїдних муфтах.
В эксперименте исследовано влияние экспериментального сахарного диабета на интенсивность экспрессии проапоптотического белка р53 в селезенке крыс. Для выявления и р53+-клеток использовали иммуногистохимический метод непрямой иммунофлюоресценции с применением моноклональных антител к р53 крысы. Установлено, что развитие экспериментального сахарного диабета сопровождается увеличением количества p53+-клеток в лимфоидных фолликулах селезенки и не влияет на их численность в периартериальных лимфоидных муфтах.
In the experiment studied the effect of experimental diabetes mellitus on the intensity of proapoptotic protein p53 expression in the spleen of rats. To detect p53 - cells immunohistochemical technique of indirect immunofluorescence with monoclonal antibodies to p53 rats have been used. Found that the development of EDM is accompanied by increasing p53+ cells in lymphatic follicles of spleen and doesn’t influence their number in PALS.number in PALS.
Важную роль в патогенезе сахарного диабета 1 типа занимают иммунологические нарушения, которые могут проявляться в разнообразных дефектах функционирования центральных и периферических органов иммуногенеза. В качестве одного из таких нарушений можно выделить дисрегуляцию герминативных центров, в которых осуществляется сложное многоуровневое взаимодействие между Т-фолликулярными хелперами Tfh, дендритными клетками и В-лимфоцитами [9]. Процесс созревания афинности антител в герминативных центрах осуществляется апоптозом и контролируется большим числом его регуляторов, от взаимодействия которых зависит уровень выживания клеток-продуцентов антител. Одним из них является проапоптотический белок р53, играющий важную роль в регуляции транскрипции и поддержании геномной стабильности. Белок р53 влияет как на внешний, так и на митохондриальный пути индукции апоптоза [3]. Действуя на последний, р53 репрессирует транскрипцию белка Bcl2 и активирует транскрипцию про-апоптотических белков Bax, Noxa, p53AIP1 и Puma [7].
Цель работы
Изучить уровень экспрессии белка р53 в селезенке крыс с экспериментальным сахарным диабетом (ЭСД), учитывая исключительную важность влияния уровня белка р53 на интенсивность апоптоза лимфоцитов.
Материалы и методы исследования
Исследования проведены на 28 самцах крыс линии Вистар массой 230-250 г (возраст 5-6 месяцев). ЭСД
моделировали однократным внутрибрюшинным введением стрептозотоцина (SIGMA, США) в дозе 50 мг/кг. Крыс с ЭСД длительностью 28 и 38 дней декапитировали под наркозом и выделяли селезенку, которую фиксировали в растворе Буэна (18 часов) и после стандартной гистологической обработки заливали в парафин. Для выявления экспрессии белка р53 в гистологических срезах селезенки использовали иммуногистохимический метод непрямой иммунофлюоресценции. В качестве первичных антител использовали кроличьи моноклональные антитела (МКАТ) к р53 крысы производства Santa Cruz Biotechnology (США), с которыми гистологические срезы инкубировали в течение 18 часов во влажной камере при Т=4оС. После отмывки избытка первичных антител в 0,1 М фосфатном буфере срезы инкубировали 60 минут (Т=37оС) со вторичными антителами в разведении 1:64. В качестве вторичных антител использовали козьи антитела к полной молекуле IgG кролика, конъюгированные с FITC (Sigma Chemical, США). После инкубации срезы промывали 0,1 М фосфатным буфером и заключали в смесь глицерина и фосфатного буфера (9:1) для последующей люминесцентной микроскопии. Исследовали лимфоидные фолликулы и периартериальные лимфоидные муфты (ПАЛМ) селезенки, изображения которых с помощью видеокамеры COHU-4922 (США) вводили в систему цифрового анализа изображения VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Германия). Анализ структуры селезенки проводили с помощью оригинального программного обеспечения, разработанного на основе макроязыка программирования VIDAS.
Таблица 1
Количество р53+-лимфоцитов в лимфоидных фолликулах селезенки крыс линии Wistar (М±т)
Серии p53+-мaлыe лимфоциты p53+-сpeдниe лимфоциты p53+-большиe лимфоциты p53+- лимфобласты Сумм. плотность p53+-лимфоцитов
Интактные (контроль) 232±14 37,1±2,2% 75±7 12,0±1,1% 130±9 20,7±1,4% 191±11 30,4±1,8% 628±24
Диабет 28 дней 504±31* 46,3±2,8%* 132±13* 12,1±1,2% 213±16* 19,5±1,5% 240±18* 22,0±1,7%* 1089±51*
Диабет 38 дней 512±30* 48,5±2,8%* 125±11* 11,8±1,0% 202±16* 19,1±1,5% 217±15 20,6±1,4%* 1057±43*
- плотность популяции р53+ лимфоцитов (на 1 мм2), в знаменателе - процентная доля отдельных
- достоверность отличий параметров р<0,05 относительно контроля.
Примечание: в числителе классов р53+-лимфоцитов; *
Результаты и их обсуждение
Развитие ЭСД (28 дней) сопровождалось увеличением количества р53+-клеток в лимфоидных фолликулах селезенки на 73% (р<0,05), по сравнению с контролем (табл. 1). Изучение распределения отдельных классов и структуры популяции р53+-клеток у данной группы экспериментальных животных показало достоверное увеличение плотности популяции всех р53+-иммунопозитивных лимфоцитов. Так, плотность популяции р53+-малых лимфоцитов увеличилась в 2,2 раза (р<0,05), р53+-средних лимфоцитов - на 76% (р<0,05), р53+-больших лимфоцитов - на 64% (р<0,05), р53+-лимфобластов - на 26% (р<0,05). При этом процентная доля р53+-малых лимфоцитов увеличилась на 25% (р<0,05), а процентная доля р53+-лимфобластов уменьшилась на 28% (р<0,05), по сравнению с контрольной группой животных (табл. 1). Развитие ЭСД сопровождалось достоверным снижением концентрации белка р53 у р53+-малых лимфоцитов и р53+-лимфобластов, по сравнению с контролем (табл. 2).
Развитие ЭСД (38 дней) сопровождалось увеличением суммарной плотности р53+-клеток в лимфоидных фолликулах селезенки на 68% (р<0,05), по сравнению с контрольной группой животных. При изучении распределения отдельных классов и структуры популяции р53+-клеток у экспериментальных животных обнаружено достоверное увеличение плотности популяции р53+-малых лимфоцитов (на 120%, р<0,05), р53+-средних лимфоцитов (на 67%, р<0,05) и р53+-больших лимфоцитов (на 55%, р<0,05). При этом увеличивалась процентная
доля р53+-малых лимфоцитов (на 31%, р<0,05) и уменьшалась процентная доля р53+-лимфобластов (на 32%, р<0,05), по сравнению с контрольной группой животных (табл. 1). Развитие ЭСД (38 дней) сопровождалось однонаправленной тенденцией по увеличению концентрации проапоптотического белка р53 в р53-иммунопозитивных клетках, по сравнению с контролем (табл. 2).
При изучении ПАЛМ селезенки контрольных крыс установлено, что суммарная плотность р53+-клеток составляет 875±45 (табл. 3). При этом отмечено преобладание р53+-малых лимфоцитов, на долю которых приходится 36% всех р53+-иммунопозитивных клеток, тогда как наименее представлены р53+-средние лимфоциты
- 12%. Развитие ЭСД (28 и 38 дней) не сопровождалось достоверным изменением количества р53+-клеток в ПАЛМ селезенки, по сравнению с контролем. Изучение распределения отдельных классов и структуры популяции р53+-клеток у данных групп экспериментальных животных показало увеличение плотности популяции и процентной доли р53+-малых лимфоцитов и снижение соответствующих показателей у р53+-лимфобластов, по сравнению с контрольной группой животных (табл. 3). При этом концентрация белка р53 изменялась разнона-правлено: у экспериментальных животных с длительностью течения ЭСД 28 дней достоверно снижалась во всех р53-клетках, по сравнению с контролем, тогда как у крыс с длительностью течения ЭСД 38 дней увеличивалась у р53+-средних лимфоцитов и не изменялась в остальных классах (табл. 4).
Таблица 2
Концентрация белка р53+ (ЕИФ) в лимфоидных фолликулах селезенки у крыс линии Wistar (М ± т)
Серии p53+ малые лимфоциты p53+ средние лимфоциты p53+ большие лимфоциты p53+ лимфобласты
Интактные (контроль) 0,408±0,004 0,433±0,007 0,448±0,005 0,504±0,006
Диабет 28 дней 0,388±0,003* 0,419±0,006 0,438±0,005 0,478±0,005*
Диабет 38 дней 0,432±0,003* 0,463±0,007* 0,488±0,006* 0,525±0,007*
Примечание: * - достоверность отличий параметров р<0,05 относительно контроля.
Таблица 3
Количество р53+-лимфоцитов в периартериальных лимфоидных муфтах селезенки крыс линии Wistar (М±т)
Серии p53+-мaлыe лимфоциты p53+-сpeдниe лимфоциты p53+-большиe лимфоциты p53+- лимфобласты Суммарная плотность p53+-лимфоцитов
Интактные (контроль) 311±23 35,5±2,6% 105±11 12,1±1,2% 174±16 20,0±1,8% 285±19 32,6±2,2% 875±45
Диабет 28 дней 384±28* 51,1±3,7%* 88±12 11,7±1,6% 131±16 17,4±2,1% 149±15* 19,8±2,1%* 751±45
Диабет 38 дней 490±26* 50,8±2,7%* 128±13 13,3±1,3% 165±15 17,1±1,6% 180±13* 18,7±1,3%* 963±40
Примечание: в числителе - плотность популяции р53+р лимфоцитов (на 1 мм2), в знаменателе - процентная доля отдельных классов р53+р лимфоцитов; * - достоверность отличий параметров р<0,05 относительно контроля.
Таблица 4
Концентрация белка р53 (ЕИФ) в периартериальных лимфоидных муфтах селезенки крыс линии Wistar (М±т)
Серии p53+-мaлыe лимфоциты p53+-сpeдниe лимфоциты p53+-большиe лимфоциты p53+-лимфоблaсты
Интактные (контроль) 0,421±0,004 0,434±0,007 0,455±0,005 0,509±0,005
Диабет 28 дней 0,355±0,004* 0,370±0,007* 0,422±0,008* 0,447±0,008*
Диабет 38 дней 0,423±0,004 0,458±0,008* 0,469±0,007 0,524±0,009
Примечание: * - достоверность отличий параметров р<0,05 относительно контроля.
Белок р53 занимает особое место в регуляции апоптоза. Он способен не только активировать гены, участвующие в индукции апоптоза, но и принимает непосредственное участие в индукции митохондриального пути клеточной смерти [1]. После активации р53 он способен поступать в митохондрии из цитоплазмы, минуя вхождение в ядро. В митохондриях р53 подвергается быстрому ферментативному деубиквитинированию и превращению в активную форму. р53 вступает во взаимодействие с BH4-доменом антиапоптотических белков BclXL и Bcl2 [4]. Связывание с антиапоптотическими белками высвобождает и активирует проапоптотические белки Bax и Bid. Все эти взаимодействия вызывают выброс цитохрома С и индукцию апоптоза даже без транскрипционной активации проапоптотических генов-мишеней р53. Прямая индукция апоптоза под действием р53, по-видимому, является первой и очень быстрой реакцией на массивные повреждения. Например, при облучении радиочувствительных тканей (тимус или селезенка) транслокация р53 в митохондрии и активация эффекторной каспазы 3 проявляются очень быстро (уже через 30 мин), т. е. задолго да наработки достаточного количества продуктов р53-регулируемых генов. Вторая волна индукции апоптоза отмечается только через 6-7
часов; она связана с транскрипционной активностью р53 в ядре [5]. Таким образом, действуя сразу на нескольких уровнях и путем использования совершенно разных механизмов, р53 осуществляет как быстрые реакции на сильные стрессы, так и реализует замедленную, но очень эффективную программу апоптоза поврежденных клеток. Использование ряда экспериментальных моделей (животные и линии клеток) позволило установить, что белок р53 может быть вовлечен в патогенез диабетических осложнений. Так, на мышах линии NOD показано, что гипергликемия приводит к апоптозу, опосредованному белком р53 [6], a у больных сахарным диабетом 1 типа в сыворотке крови обнаруживаются анти-р53-аутоантитела [8], увеличивается интенсивность р53-индуцированного апоптоза [2].
В целом, обнаруженные изменения экспрессии про-апоптотического белка р53 в селезенке могут являться одним из факторов, поддерживающих прогрессирование аутоиммунной патологии, т. к. вызывают дисбаланс про- и антиапоптотических стимулов и могут влиять на уровень выживания спленоцитов, продуцирующих высокоаффинные антитела к собственным антигенам, в том числе и к панкреатическим.
Литература
1. Braithwaite A. The p53 story: layers of complexity / A. Braithwaite, J. Royds, P Jackson // Carcinogenesis. - 2005. -Vol. 26. - P. 1161-1169.
2. Diabetes increases p53-mediated apoptosis following ischemia / L. Jazayeri, M. Callaghan, R. Grogan [et al.] // Plast. Reconstr. Surg. - 2008. - Vol. 121. - P. 1135-1143.
3. Harris S. The p53 pathway: positive and negative feedback loops / S. Harris, A. Levine // Oncogene. - 2005. - Vol. 24.
- P. 2899-2908.
4. HemannM. The p53-Bcl-2 connection / Hemann M., Lowe S. // Cell Death and Differentiation. - 2006. - Vol. 13. - P. 1256-1259.
5. In vivo mitochondrial p53 translocation triggers a rapid first wave of cell death in response to DNA damage that can precede
p53 target gene activation / S. Erster, M. Mihara, R. Kim [et al.] // Mol. Cell Biol. - 2004. - Vol. 34. - P. 6728-6741.
6. Keim A. Hyperglycemia-induced apoptotic cell death in the mouse blastocyst is dependent on expression of p53 / A. Keim, M. Chi, K. Moley // Mol. Reprod. Dev. - 2001. - Vol. 60. - P. 214-224.
7. Oren M. Decision making by p53: life, death and cancer / M. Oren // Cell Death Differ. - 2003. - Vol. 10. - P. 431-442.
8. Serum anti-p53 autoantibodies in patients with type 1 diabetes / E. Cesare, M. Previti, F. Lombardo [et al.] // Ann. Clin. Lab. Sci. - 2001. - Vol. 31. - P. 253-258.
9. Vinuesa C. Dysregulation of germinal centres in autoimmune disease / C.Vinuesa, I. Sanz, C. Cook // Nature Reviews Immunology. - 2009. - Vol. 9. - P. 845-857.
Сведения об авторах:
Камышный А.М., д. мед. н., доцент, зав. каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии ЗГМУ Гриневич И.В., ассистент каф. патологической физиологии ЗГМУ.
Камышная В.А., к. мед. н., ст. преподаватель каф. анатомии человека ЗГМУ.
Адрес для переписки:
Гриневич И.В. 69035, г. Запорожье, пр-т Маяковского 26, ЗГМУ, каф. патологической физиологии ЗГМУ Тел.: (0612) 34 35 61, (0612) 34 27 22.
E-mail: azx_grinn@optima.com.ua